INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DO MIR-148A-5P NO PROCESSO METASTÁTICO DO CÂNCER DE TIREOIDE

RESUMO

INTRODUÇÃO: A identificação pacientes com potencial para uma má evolução é importante na tomada de decisão da melhor abordagem aos tumores da tireoide, que pode variar desde a simples vigilância ativa a medidas terapêuticas agressivas. Os MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes com papel crucial na regulação da expressão genética e, portanto, na patogênese e progressão de diferentes tipos de neoplasia. A relação do câncer de tireoide e miRNAs como possíveis biomarcadores vêm sendo amplamente investigada na última década, podendo estes ser encontrados em tecidos específicos e no sangue. Em um trabalho prévio do nosso grupo, utilizando ferramentas de bioinformática e dados disponíveis no TCGA, demonstramos que o miR-148a-5p está desregulado no câncer de tireoide (CT) com metástase linfonodal. Além disso, a baixa expressão deste miRNA já foi fortemente associada à pior sobrevida em pacientes com câncer gástrico e adenocarcinoma ductal pancreático. Portanto, com base na participação que os miRNAs apresentam na carcinogênese e pela sua fácil manipulação, podem ser utilizados para diagnóstico e prognóstico de pacientes com CT. OBJETIVOS: Avaliar a participação do miR-148a-5p no processo de migração celular do CT em cultura celular utilizando ensaio de Lesão de Monocamada, bem como, avaliar a participação deste no processo de migração e invasão celular em cultura celular utilizando ensaio Câmara de Boyden. MÉTODOS: Utilizamos células derivadas de duas linhagens provenientes do carcinoma papilífero da tireoide (CPT), que possuem mutações de RET e de BRAF, as mais comumente encontradas. Foi realizada uma lesão na monocamada das duas linhagens celulares (TPC-1 e BCPAP), e um controle não-transfectado foi utilizado como referência (Mock). As células foram transfectadas com miméticos de miR-148a-5p em diferentes concentrações (5, 10, 15 e 20 nM ou Mock). Fotografias foram tiradas com exposição 0, após 16 horas e 24 horas. Também utilizamos as linhagens TPC-1 e BCPAP para o ensaio em Câmara de Boyden modificada, a qual continha insertos de membrana com poros de 8,0μm. Após a transfecção, as células foram ressuspendidas em meio contendo soro fetal bovino e plaqueadas no compartimento superior da câmara. O compartimento inferior foi preenchido com meio contendo 10% de soro fetal bovino. Após 12 horas o meio de cultura foi removido, as células do compartimento superior removidas e as células no compartimento inferior fixadas. Para os ensaios de invasão celular utilizamos matriz extracelular diluída em DMEM. Foram plaqueados 30μL de matriz diluída na parte superior de cada inserto. Após o plaqueamento da matriz, a placa contendo os insertos foi colocada em estufa a 37oC durante duas horas para solidificação. Posteriormente a preparação dos insertos, seguiu-se o mesmo protocolo de plaqueamento, coleta das amostras e fotografia do ensaio de migração. RESULTADOS: Os resultados demonstram que ao restaurar a expressão de miR-148a-5p, houve redução na migração celular, tanto na linhagem de células TPC-1 quanto com as células BCPAP. Através do ensaio de migração celular por câmara de Boyden modificada, a restauração dos níveis do mir-148a-5p nas linhagens celulares diminuiu a migração celular, sendo menos expressiva nas células TPC-1. Através do ensaio de transwell e adição de matriz extracelular, observamos diminuição da invasão celular, mais significativa na linhagem BCPAP do que na linhagem TPC-1, de maneira similar aos demais ensaios. DISCUSSÃO: Este estudo é o primeiro a descrever a correlação da desregulação do miR-148a-5p com a migração, invasão e consequente mau prognóstico no carcinoma de tireoide. Esse miRNA já foi previamente relacionado a pior prognóstico no câncer gástrico e pancreático. Ambos demonstraram menor expressão do miR-148a-5p no tecido maligno em relação ao tecido normal, assim como menor taxa de sobrevida. Nossos resultados confirmam a participação do miR-148a-5p na migração das células TPC-1 e BCPAP, linhagens de carcinoma papilífero humano, que possuem rearranjo cromossômico RET e a mutação BRAF, respectivamente. CONCLUSÃO: Nossos dados indicam que a desregulação negativa de miR-148a-5p está relacionada com a migração e invasão da célula neoplásica tireoidiana, de modo a corroborar a ideia de que participa do processo metastático do CT e ainda pode ser utilizado como marcador de prognóstico e/ou no seguimento dos pacientes com tumores de tireoide.

PALAVRA-CHAVE: câncer de tireoide; miRNA-148a-5p; nódulos da tireoide