Diagnóstico por PCR de infecções congênitas TORCH no líquido cefalorraquidiano de recém nascidos do CAISM Unicamp

RESUMO

INTRODUÇÃO: O risco de transmissão da mãe para o feto depende do tipo de infecção e do tempo de gestação. Geralmente, as condições mais graves são adquiridas no primeiro trimestre da gravidez. Algumas dessas infecções são oriundas dos patógenos TORCH: Toxoplasmose, Rubéola, Citomegalovírus (CMV), Herpes simplex tipos 1 e 2 (HSV 1 e 2) e outros, como Varicela Zoster (VZV), Parvovírus B19 e Zika. As consequências são natimortalidade, prematuridade, retardo do crescimento uterino e malformações congênitas (1). A detecção de DNA/RNA no líquido cefalorraquidiano (LCR) por reação em cadeia da polimerase (PCR) é um marcador de infecção congênita no sistema nervoso (2).

OBJETIVOS: Identificar os principais patógenos causadores de infecção congênita em amostras de LCR de recém-nascidos (RN) com suspeita destas infecções, atendidos no Hospital da Mulher Professor Doutor José Aristodemo Pinotti – Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM), Campinas/SP, através da utilização de metodologia molecular. Padronizar e validar essa metodologia através da avaliação dos prontuários dos recém-nascidos suspeitos de infecção congênita, provenientes do CAISM.

MÉTODOS: TIPO DE ESTUDO: DESCRITIVO PROSPECTIVO Foram estudadas amostras de LCR de neonatos (1 a 28 dias), com suspeita de infecção congênita, atendidos na Unidade Neonatal do CAISM, de 2017 a 2021. A amostragem foi por conveniência e estabelecemos 150 amostras, devido à limitação de coleta e análise laboratorial, bem como o prazo para conclusão do estudo. As amostras foram enviadas para pesquisas citológicas e bioquímicas, solicitadas para condução clínica do caso, ao Laboratório de Líquidos Biológicos do Departamento de Patologia Clínica do Hospital de Clínicas da Unicamp. O material remanescente foi estocado em freezer a -20 graus e encaminhado ao Laboratório de Virologia da FCM/UNICAMP, onde foram armazenados em freezer a -80°C. O estudo não solicitou coletas adicionais, não oferecendo nenhum prejuízo aos pacientes. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) de acordo com as normas previstas na resolução Nº466/12, do Conselho Nacional de Saúde e já foi aprovado via Plataforma Brasil (CAE: 86760218.3.0000.5404). Uma vez descongelado, o LCR foi submetido à extração de DNA e RNA e serviu para as análises moleculares sobre a presença dos genomas dos patógenos estudados. Em seguida foram realizadas a PCR, Nested-PCR e RT-NPCR, para identificar os agentes TORCH. O DNA da amostra foi extraído a partir de 200ul de LCR, utilizando kit da marca BIOPUR Mini Spin Plus, seguindo orientações do fabricante. O volume obtido foi de 200ul. Para monitorar a presença de inibidores, primers do gene da Beta2-microglobulina (F: GGTGTCTTGAGGCTCAGGGAG; R: CAACTTCAATGTCAATGTCGATGGATG) foram incluídos em cada amostra como controle. A extração do DNA foi repetida quando as amostras da PCR para o gene da Beta2-microglobulina não foram positivas. O RNA da amostra foi extraído a partir de 140ul da amostra de LCR, utilizando-se o SV Total RNA Isolation System. O volume obtido foi de 200ul. Para a reação de transcrição reversa (RT) foi utilizado o Access Quick TM RT-PCR System kit (Promega). Após, foi obtido o cDNA e armazenado a -20 ºC. As variáveis dos recém-nascidos que foram coletadas do prontuário são: sexo, idade, antecedentes gestacionais da mãe e neonatais (peso, perímetro cefálico e comprimento ao nascer; idade gestacional, índice de Apgar 1º e 5º minutos, anomalias de qualquer sistema, presença ou não de microcefalia e quaisquer outras intercorrências), com respectivos exames complementares e evolução clínica.

RESULTADOS: As causas de coleta de LCR mais frequentes foram, em ordem decrescente: sepse (51 = 34%), malformação (19 = 12,67%), convulsões (17 = 11,3%), microcefalia (3 = 2,0%). Obtivemos, dentre as 150 amostras de líquor dos recém-nascidos provenientes do CAISM, duas amostras com detecção positiva para HSV1 (1,3%), quatro amostras positivas para VZV (2,67%), uma positiva para CMV (0,67%), duas para Toxoplasmose (1,3%), três para Parvovírus B19 (2,0%) e quatro para Zika vírus (2,67%). Embora a literatura cite como causa de Infecção Congênita mais frequente o CMV (3,4), isso não foi encontrado nessa amostragem. Dentre as malformações citadas nos prontuários dos pacientes cujo líquor havia sido coletado, temos: dois pacientes com Malformação de Arnold Chiari tipo II e outro com Encefalocele occipital e Microcefalia (um de cada positivo para Parvovírus B19); oito casos de Hidrocefalia (um positivo para Zika vírus); um caso de Mielomeningocele lombossacra rota (positivo para Zika); um gemelar com Cisto occipitocervical, Disrafismo e Ventriculomegalia enquanto seu irmão apresentou Encefalocele occipital; dois pacientes com Macrocrania; três casos de Microcefalia (um positivo para Toxoplasmose).

CONCLUSÃO: Dessa forma, concluímos que os principais patógenos causadores de infecção congênita em amostras de LCR de recém-nascidos, no CAISM, foram Zika Vírus, VZV e Parvovírus B19, obtidos através da detecção do genoma viral por métodos moleculares. Algumas dessas amostras positivas foram em pacientes com malformações congênitas, sugerindo a relevância clínica da pesquisa destes patógenos pela metodologia molecular.

BIBLIOGRAFIA: 1. Cofré F, Delpiano L, Labraña Y, Reyes A, Sandoval A, Izquierdo G. Síndrome de TORCH: Enfoque racional del diagnóstico y tratamiento pre y post natal.: Recomendaciones del Comité Consultivo de Infecciones Neonatales Sociedad Chilena de Infectología. Rev Chilena Infectol 2016; 33 (2): 191-216. 2. Leite AA, Honório SR, Torres GR, Errante PR. Análise do líquido cefalorraquidiano. Revisão de literatura. Atas de Ciências da Saúde, São Paulo, JUL-SET 2016. Vol.4, N°.3, p. 1-24. 3. Neu N, Duchon J, Zachariah P. TORCH infections. Clin Perinatol. 2015 Mar; 42(1):77-103, viii. doi: 10.1016/j.clp.2014.11.001. Epub 2014 Dec 20. 4. Karen E Johnson, MD. Overview of TORCH infections. Literature review current through: version May 2023. Available from:

PALAVRA-CHAVE: Infecção congênita; Reação em Cadeia da Polimerase; Líquido Cefalorraquidiano.