MICRORNAS COMO POTENCIAIS BIOMARCADORES DE DIAGNÓSTICO DA COVID-19

RESUMO

INTRODUÇÃO: Em março de 2020 foi declarada a pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), a qual tem como agente etiológico o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) (1). O diagnóstico da COVID-19 pode ser realizado através de testes sorológicos, tomografia computadorizada (TC) e testes para detecção do vírus (2–4), entretanto, em virtude das limitações encontradas nos testes disponíveis atualmente, métodos alternativos para o diagnóstico da COVID-19, como a identificação de novos biomarcadores para a doença, se fazem necessários. Os microRNAs (miRNAs) são moléculas pequenas de cadeia simples de RNA formadas por aproximadamente 22 nucleotídeos não codificantes, que participam da regulação pós-transcricional da expressão gênica (5,6). Pelo fato dos miRNAs serem altamente estáveis nos diversos fluidos extracelulares e devido à sua expressão específica em diferentes tecidos e estados patológicos, os miRNAs circulantes têm sido alvos de investigações como possíveis biomarcadores de várias doenças, incluindo as infecciosas, como a COVID-19 (7,8). Um estudo preliminar publicado pelo nosso grupo de pesquisa, identificou através de sequenciamento de nova geração, o miR-4433b-5p diferentemente expresso entre pacientes com COVID-19 e controles, com um Fold Regulation (FR) de -2,15 (9).

OBJETIVOS: Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo validar a expressão do miR-4433b-5p por RT-qPCR, que é a técnica padrão-ouro para este tipo de análise, e a construção de curvas ROC para avaliar a sensibilidade e especificidade desse miRNA como biomarcador da COVID-19.

MÉTODOS: Os pacientes com COVID-19 (grupo Caso) foram recrutados do Hospital Estadual Sumaré Dr. Leandro Francheschini (HES) na cidade de Sumaré (SP, Brasil) e estratificados em casos leves/moderados e casos graves/críticos, (n=85), enquanto os voluntários saudáveis foram recrutados da comunidade UNICAMP (n=40). Após a extração dos miRNAs com o kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen), foi realizada a síntese de cDNA utilizando o TaqMan™ Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems) e a qPCR utilizando o TaqMan™ Advanced miRNA Assays (Applied Biosystems). Além dos miR-4433b-5p, também foi realizada a qPCR dos controles endógenos, miR-34a-3p e miR-205-3p, para normalização dos resultados. As análises dos miRNAs foram feitas através do Rotor-Gene Q Series Software. As expressões relativas dos miRNAs foram obtidas através do método 2-∆CT, onde ∆CT = CT miR candidato – CT controle endógeno previamente selecionado. O nível de significância adotado foi de 5%. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FCM/UNICAMP (CAAE 36041420.0.000.5404 e 31049320.7.1001.5404).

RESULTADOS: O miR-4433b-5p mostrou uma tendência, embora sem diferença significativa, a estar diferentemente expresso entre os grupos caso e controle tanto quando normalizado pelo miR-34-3p quando pelo miR-205-3p. Entretanto, quando o grupo caso foi estratificado, se observou que o miR-4433b-5p, quando normalizado pelo miR-34, está diferentemente expresso tanto entre os grupos grave/crítico versus leve/moderado quanto entre os grupos grave/crítico versus controle, com um valor de p de 0,0036. Já quando este miRNA é normalizado pelo miR-205, todos os grupos diferem entre si, com um valor de p<0,0001. As curvas ROC apontaram uma sensibilidade de 71,1% e uma especificidade de 92,5% entre os grupos leve/moderado e controle, e uma sensibilidade de 70% e uma especificidade de 87,5% entre os grupos grave/crítico e controle, quando o miR-4433b-5p foi normalizado pelo miR-205, entretanto, quando normalizado pelo miR-34, valores moderados de sensibilidade e especificidade somente foram obtidos entre os grupos grave/crítico e controle.

CONCLUSÃO: O miR-4433b-5p se mostrou um marcador sensível e específico para o diagnóstico da COVID-19, quando normalizado pelo miR-205, nas comparações grupo leve/moderado versus controle e grupo grave/crítico versus controle, embora não tenha sido encontrada diferença significativa entre o grupo caso e o controle.

BIBLIOGRAFIA: 1. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol. 2020;5(4):536–44. 2. Castro R, Luz PM, Wakimoto MD, Veloso VG, Grinsztejn B, Perazzo H. COVID-19: a meta-analysis of diagnostic test accuracy of commercial assays registered in Brazil. Brazilian J Infect Dis [Internet]. 2020;24(2):180–7. Available from: https://doi.org/10.1016/j.bjid.2020.04.003 3. Majumder J, Minko T. Recent Developments on Therapeutic and Diagnostic Approaches for COVID-19. AAPS J. 2021;23(1). 4. Torretta S, Zuccotti G, Cristofaro V, Ettori J, Solimeno L, Battilocchi L, et al. Diagnosis of SARS-CoV-2 by RT-PCR Using Different Sample Sources: Review of the Literature. Ear, Nose Throat J. 2021;100(2_suppl):131S-138S. 5. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science (80- ). 2001;294(5543):853–8. 6. Lee RC, Ambros V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science (80- ). 2001;294(5543):862–4. 7. Wang K, Zhang S, Marzolf B, Troisch P, Brightman A, Hu Z, et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(11):4402–7. 8. Correia CN, Nalpas NC, McLoughlin KE, Browne JA, Gordon S V., MacHugh DE, et al. Circulating microRNAs as potential biomarkers of infectious disease. Front Immunol. 2017;8(FEB):1–17. 9. Nicoletti A de S, Visacri MB, da Ronda CR da SC, Vasconcelos PE do NS, Quintanilha JCF, de Souza RN, et al. Differentially expressed plasmatic microRNAs in Brazilian patients with Coronavirus disease 2019 (COVID-19): preliminary results. Mol Biol Rep [Internet]. 2022;49(7):6931–43. Available from: https://doi.org/10.1007/s11033-022-07338-9

PALAVRA-CHAVE: COVID-19, MicroRNAs, MiRNAs, Biomarcadores