PRODUÇÃO DE ESFERÓIDES PARA DIFERENCIAÇÃO CONDROGÊNICA À PARTIR DE CÉLULAS TRONCO DE LÍQUIDO AMNIÓTICO HUMANO

RESUMO

INTRODUÇÃO: Lesões da cartilagem são de difícil tratamento. Atualmente, dentro do campo da Medicina Regenerativa apresenta-se como alternativa promissora o uso de células tronco diferenciadas em condrócitos. O cultivo celular em alta densidade promove maior interação entre as células e formação de matriz extracelular, com maior grau de semelhança ao que ocorre in vivo durante a condrogênese. Acredita-se que futuramente os esferóides poderão ser utilizados clinicamente para o reparo de tecidos lesionados.

OBJETIVOS: Avaliar a eficiência da formação de esferóides utilizando método comercial dos kits para Cultura em 3D a partir de células tronco obtidas de líquido amniótico humano sob estímulo condrogênico.

MÉTODOS: Para padronização da técnica utilizamos células tronco provenientes de amostras de líquido amniótico humano (LAh) de pacientes gestantes submetidas ao procedimento de amniocentese, por indicação médica formal conforme protocolo específico do Serviço de Medicina Fetal do Hospital das Clínicas da UNICAMP – CAISM (CAAE 97996818.0.0000.5404). Após a primeira etapa de expansão em monocamada as células foram incubadas com beads magnéticas formadas por ouro, ferro e poli-L-lisina (Nanoshuttles™ - Greiner Bio-One) na proporção de 1µL para cada 10x10³ células overnight à 37°C. As células foram tripsinizadas e inoculadas em uma placa de 96 poços com a superfície tratada para evitar adesão celular utilizando o 96-well Bioprinting-Assambler™ Kit (Greiner Bio-One) divididas em três grupos com diferentes concentrações celulares: 50, 150 e 300 mil células por poço. A placa foi sobreposta ao suporte com imã para formação da estrutura 3D. (Figura 1) Após 24 horas a placa foi desacoplada do suporte. Foi utilizado meio para diferenciação condrogênica composto por DMEM alta glicose (Dulbecco’s modified Eagle’s médium high glucose– GIBCO) suplementado com ácido ascórbico (50µg/ml – Sigma Aldrich), Prolina (40µg/ml - Sigma Alderich); insulin-transferrin-selenium (ITS+1- 1% - Sigma Aldrich), dexametasona 0,1µM (Sigma Aldrich) e 10 ng/ml do fator de crescimento TGF-β3 (R&D Systems). As células foram estimuladas durante 14 dias com trocas de meio de cultura a cada 3 a 4 dias. Os esferóides produzidos foram observados quanto a sua morfologia e processo de agregação celular por meio de registro de imagem em microscópio óptico invertido (Olympus). As estruturas formadas foram análisadas quanto a composição do tecido formado por meio da coloração de Hematoxilina e Eosina (HE) (Sigma) e a matriz formada por colorações específicas para tecido cartilaginoso como o Tricrômio de Masson (TM), Picrossirius Red (PR) e Azul de Alcian (AA). Os cortes foram visualizados e fotografados em microscópio óptico (Leica DM2500) e analisados em software específico (Leica Application Suite LAS Version 4.6.2) também quanto ao seu diâmetro.

RESULTADOS: Durante as etapas de cultivo celular observou-se uma rápida agregação celular desde as primeiras 2 às 24 horas seguintes. Após 3 dias observou-se a etapa de compactação celular e proliferação. Ao final dos 14 dias de cultivo com meio condrogênico suplementado com TGF-β3, os cortes mantiveram a formação de estruturas coesas, de formato esférico. (Figura 2) Observou-se melhor uniformidade no processo no grupo formado a partir de 50 mil células por esferóide. Neste grupo, a produção de matriz extracelular foi analisada por colorações histológicas específicas para colágeno e glicosaminoglicanos como evidencia a Figura 3. Em (A) coloração por HE apresenta os núcleos celulares em roxo e a matriz neoformada em rósea, (B) a coloração Azul de Alcian evidencia em azul claro os glicosaminoglicanos, em (C) o Tricrômio de Masson marca fracamente o colágeno produzido em azul e (D) na coloração de Picrossirius Red observam-se em destaque fibras colágenas que nesta coloração podem variar de tonalidade entre amarelo pálido até vermelho intenso. Os esferóides de LAh formados apresentaram diâmetro de aproximadamente 600 µm. Nas imagens dos esferóides formados é possível visualizar ainda resíduos das beads magnéticas em preto incorporadas à estrutura formada.

CONCLUSÃO: Durante as etapas de cultivo celular observou-se uma rápida agregação celular desde as primeiras 2 às 24 horas seguintes. Após 3 dias observou-se a etapa de compactação celular e proliferação. Ao final dos 14 dias de cultivo com meio condrogênico suplementado com TGF-β3, os cortes mantiveram a formação de estruturas coesas, de formato esférico. (Figura 2) Observou-se melhor uniformidade no processo no grupo formado a partir de 50 mil células por esferóide. Neste grupo, a produção de matriz extracelular foi analisada por colorações histológicas específicas para colágeno e glicosaminoglicanos como evidencia a Figura 3. Em (A) coloração por HE apresenta os núcleos celulares em roxo e a matriz neoformada em rósea, (B) a coloração Azul de Alcian evidencia em azul claro os glicosaminoglicanos, em (C) o Tricrômio de Masson marca fracamente o colágeno produzido em azul e (D) na coloração de Picrossirius Red observam-se em destaque fibras colágenas que nesta coloração podem variar de tonalidade entre amarelo pálido até vermelho intenso. Os esferóides de LAh formados apresentaram diâmetro de aproximadamente 600 µm. Nas imagens dos esferóides formados é possível visualizar ainda resíduos das beads magnéticas em preto incorporadas à estrutura formada.

BIBLIOGRAFIA: Gionet-Gonzales MA, Leach JK. Engineering principles for guiding spheroid function in the regeneration of bone, cartilage, and skin. Biomed Mater. 2018 Mar 21;13(3):034109. doi: 10.1088/1748-605X/aab0b3. PMID: 29460842; PMCID: PMC5898817. PMCID: PMC5614363. Tseng H, Gage JA, Haisler WL, Neeley SK, Shen T, Hebel C, Barthlow HG, Wagoner M, Souza GR. A high-throughput in vitro ring assay for vasoactivity using magnetic 3D bioprinting. Sci Rep. 2016 Aug 1;6:30640. doi: 10.1038/srep30640. PMID: 27477945; PMCID: PMC4967891.

PALAVRA-CHAVE: Esferóides, cartilagem, células tronco, líquido amniótico, condrogênese